Chẩn đoán bệnh cúm lợn bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu chuột lang như thế nào? Phản ứng được thực hiện ra sao?

Nội dung chính

• Để chẩn đoán bệnh cúm lợn thì cần dùng những thiết bị dụng cụ nào?
• Chẩn đoán bệnh cúm lợn bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu chuột lang như thế nào?
• Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu chuột lang thực hiện ra sao?

Để chẩn đoán bệnh cúm lợn thì cần dùng những thiết bị dụng cụ nào?

Để chẩn đoán bệnh cúm lợn thì cần dùng những thiết bị dụng cụ nào? (Hình từ Internet)

Theo Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-25:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 25: Bệnh cúm lợn quy định về thiết bị, dụng cụ để chẩn đoán bệnh cúm lợn như sau:

Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm sinh học và cụ thể như sau:

4.1. Cối, chày sứ.

4.2. Pipet, có đầu típ các cỡ 30 μl, 200 μl và 1000 μl sử dụng cho micropipet (có lọc và không lọc).

4.3. Đĩa 96 giếng đáy chữ V hoặc chữ U.

4.4. Kính hiển vi đảo ngược

4.5. Máy ly tâm, có thể thực hiện ở gia tốc 500 g, 900 g, 100 g và 8 000 g.

4.6. Máy lắc ống (vortex mixer).

4.7. Máy Realtime RT-PCR hoặc máy PCR.

4.8. Tủ ấm có chứa 5 % CO2, duy trì được ở 37 °C.

4.9. Xi lanh, dung tích 1 ml và 5 ml,-

4.10. Ống effendorf, dung tích 1,5 ml.

4.11. Chai nuôi tế bào 75 cm2.

4.12. Màng lọc, có kích thước lỗ lọc là 0,45 μm.

Theo đó, thiết bị và dụng cụ dùng để chẩn đoán bệnh cúm lợn gồm:

- Cối, chày sứ.

-. Pipet, có đầu típ các cỡ 30 μl, 200 μl và 1000 μl sử dụng cho micropipet (có lọc và không lọc).

- Đĩa 96 giếng đáy chữ V hoặc chữ U.

- Kính hiển vi đảo ngược

- Máy ly tâm, có thể thực hiện ở gia tốc 500 g, 900 g, 100 g và 8 000 g.

- Máy lắc ống (vortex mixer).

- Máy Realtime RT-PCR hoặc máy PCR.

- Tủ ấm có chứa 5 % CO2, duy trì được ở 37 °C.

- Xi lanh, dung tích 1 ml và 5 ml,-

-. Ống effendorf, dung tích 1,5 ml.

- Chai nuôi tế bào 75 cm2.

- Màng lọc, có kích thước lỗ lọc là 0,45 μm.

Chẩn đoán bệnh cúm lợn bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu chuột lang như thế nào?

Theo tiết 5.2.3.1 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-25:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 25: Bệnh cúm lợn quy định về phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu chuột lang như sau:

Cách tiến hành

...

5.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

5.2.3.1. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu chuột lang

Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (phản ứng HI: (Xem phụ lục C) dùng để kiểm tra kháng thể kháng vi rút cúm lợn H1, H3 trong huyết thanh kiểm tra.

Huyết thanh kiểm tra cần được vô hoạt bổ thể ở 56 °C trong 30 min và huyết thanh đó cần phải được xử lý RDE (Xem A5 phụ lục A) chống hiện tượng ức chế giả.

Chuẩn bị kháng nguyên: Kháng nguyên chuẩn H1 và H3 được pha 4 đơn vị HA (Xem A.10 phụ lục A).

Thực hiện phản ứng HI: Huyết thanh kiểm tra đã xử lý RDE (Xem A.5 phụ lục A) pha loãng với dung dịch đệm PBS ~ pH 7,2 (Xem A.3 phụ lục A) sau đó bổ sung kháng nguyên chuẩn đã pha loãng 4HA. Ủ huyết thanh kiểm tra và kháng nguyên chuẩn thời gian là 40 min sau đó cho tác dụng với hồng cầu chuột lang 0,5 %.

Đánh giá kết quả:

- Mẫu có kháng thể kháng vi rút cúm lợn H1 hoặc H3: Dương tính với phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu chuột lang (Xem phụ lục C).

- Mẫu không có kháng thể vi rút cúm lợn H1 hoặc H3: Âm tính với phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu chuột lang (Xem phụ lục C).

...

Như vậy cần thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (phản ứng HI) dùng để kiểm tra kháng thể kháng vi rút cúm lợn H1, H3 trong huyết thanh kiểm tra.

Cần chuẩn bị huyết thanh cho quá trình kiểm tra, huyết thanh phải được vô hoạt bổ thể ở 56 °C trong 30 min và huyết thanh đó cần phải được xử lý RDE chống hiện tượng ức chế giả. Bên cạnh đó cần có kháng nguyên chuẩn H1 và H3 được pha 4 đơn vị HA.

Thực hiện phản ứng HI: Huyết thanh kiểm tra đã xử lý RDE pha loãng với dung dịch đệm PBS ~ pH 7,2 sau đó bổ sung kháng nguyên chuẩn đã pha loãng 4HA. Ủ huyết thanh kiểm tra và kháng nguyên chuẩn thời gian là 40 min sau đó cho tác dụng với hồng cầu chuột lang 0,5 %.

Mẫu có kháng thể kháng vi rút cúm lợn H1 hoặc H3: Dương tính với phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu chuột lang. Mẫu không có kháng thể vi rút cúm lợn H1 hoặc H3: Âm tính với phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu chuột lang.

Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu chuột lang thực hiện ra sao?

Theo Phụ lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-25:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 25: Bệnh cúm lợn quy định về phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu chuột lang như sau:

PHỤ LỤC C

(Quy định)

Cách tiến hành phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu chuột lang (HI)

C.1. Thuốc thử, môi trường và vật liệu thử

- Dung dịch PBS pH ~7,2 (Xem A.3 phụ lục A)

- Hồng cầu chuột lang 0,5 % (Xem A.4 phụ lục A)

- Huyết thanh kiểm tra 1/10 đã được xử lý RDE (Xem A.5 phụ lục A) hoặc kháng huyết thanh chuẩn cúm lợn H1 và H3 đã pha loãng 1/10.

- Kháng nguyên chuẩn H1, H3 (dịch môi trường sau khi phân lập trên tế bào hoặc dung dịch niệu mô sau khi phân lập trên trứng).

- Kháng nguyên chuẩn H1, H3 hoặc dịch môi trường sau khi phân lập trên tế bào, dung dịch niệu mô sau khi phân lập trên trứng dương tính ở Phụ lục B dùng cho phản ứng HI được pha 8 HA/50 μl hoặc (4 HA/25 μl) (Xem A.10 phụ lục A).

C.2. Thiết bị, dụng cụ

Đĩa ngưng kết 96 giếng (Xem 4.3), đáy chữ V, pipet (Xem 4.2) các loại với đầu típ các loại.

C.3. Cách tiến hành (Xem sơ đồ 2)

Cho 25 μl PBS pH -7,2 vào các giếng từ giếng 2 đến giếng 12. Cho 50 μl huyết thanh cần kiểm tra vào giếng 1. Chuyển 25 μl từ giếng 1 sang giếng 2.

Trộn đều huyết thanh với PBS ở giếng 2, rồi chuyển 25 μl sang giếng 3 và trộn đều, chuyển 25 μl sang giếng 4, tiếp tục cho đến giếng 11, hút bỏ 25 μl ở giếng 11.

Cho 25 μl kháng nguyên 4 HA/25 μl (hoặc 8 HA/50 μl) vào các giếng từ 1 đến 11. Giếng 12 cho thêm 25 μl PBS làm đối chứng hồng cầu. Lắc nhẹ trên máy lắc (Xem 4.6) sau đó để đĩa ở nhiệt độ phòng 30 min.

Cho 50 μl hồng cầu chuột lang 0,5 % vào mỗi giếng, lắc (Xem 4.6) nhẹ trong 1 min. Để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng. Đọc kết quả sau 30 min đến 60 min.

Mỗi đĩa phản ứng phải có mẫu đối chứng kháng nguyên chuẩn hoặc kháng thể chuẩn làm tương tự như mẫu cần chẩn đoán để đảm bảo 4 HA/25 μl (hoặc 8 HA/50 μl) đã được sử dụng cho phản ứng là đúng, mục đích là để kiểm soát mẫu huyết thanh và mẫu bệnh phẩm khi làm phản ứng (mẫu này được gọi là đối chứng nội).

Sơ đồ 2 - Các bước tiến hành phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu chuột lang (HI)

C.4. Đọc kết quả

- Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy, chứng tỏ kháng nguyên và kháng thể tương ứng. Hiệu giá kháng thể được tính ở độ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ức chế ngưng kết hoàn toàn.

- Phản ứng âm tính: Có hạt ngưng kết lấm tấm, chứng tỏ không có kháng thể kết hợp với kháng nguyên trong phản ứng.

Theo đó các bước thực hiện phản ứng ngưng kết hồng cầu chuật lang để thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu chuột lang nhằm chẩn đoán bệnh cúm lợn được thực hiện theo tiêu chuẩn nêu trên.

Kết quả cho phản ứng dương tính khi hồng cầu lắng xuống đáy, chứng tỏ kháng nguyên và kháng thể tương ứng. Hiệu giá kháng thể được tính ở độ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ức chế ngưng kết hoàn toàn.

Trường hợp phản ứng âm tính khi có hạt ngưng kết lấm tấm, chứng tỏ không có kháng thể kết hợp với kháng nguyên trong phản ứng.