Trong quá thực hiện phương pháp Realtime RT PCR để chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm thì người thực hiện thử nghiệm cần lưu ý gì để đảm bảo sức khỏe khi chẩn đoán?

Nội dung chính

• Phát hiện tôm sú giống mắc bệnh đầu vàng thông quan những triệu chứng lâm sàng nào?
• Thực hiện phương pháp Realtime RT PCR chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm sú giống ra sao?
• Trong quá thực hiện phương pháp Realtime RT PCR để chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm thì người thực hiện thử nghiệm cần lưu ý gì để đảm bảo sức khỏe khi chẩn đoán?

Phát hiện tôm sú giống mắc bệnh đầu vàng thông quan những triệu chứng lâm sàng nào?

Theo Mục 5 TCVN 8710-4:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm quy định về triệu chứng lâm sàng của tôn khi mắc bệnh đầu vàng như sau:

"5 Chẩn đoán lâm sàng

5.1 Đặc điểm dịch tễ

Những loài tôm mẫn cảm với vi rút đầu vàng (YHV1) gồm tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) và một số loại tôm khác.

Tôm sú mẫn cảm với YHV1 từ giai đoạn hậu ấu trùng (PL15). Các loài tôm khác có thể nhiễm bệnh ở các giai đoạn khác nhau nhưng thường xảy ra ở giai đoạn từ 40 ngày đến 70 ngày tuổi. Tỉ lệ chết có thể đến 100% trong vòng từ 3 ngày đến 5 ngày kể từ khi quan sát thấy dấu hiệu bệnh lý.

Vi rút đầu vàng (YHV1) có thể lây truyền theo chiều ngang từ thức ăn nhiễm vi rút, tôm nhiễm bệnh bài tiết vi rút ra môi trường hoặc một số tôm tự nhiên nhiễm YHV1 lây truyền cho các tôm trong ao nuôi. Những cá thể nhiễm bệnh mạn tính có thể truyền vi rút sang con cháu qua đường sinh sản.

5.2 Triệu chứng lâm sàng

Tôm ăn nhiều bất thường rồi đột ngột ngừng ăn và chết sau 2 ngày đến 4 ngày. Tỷ lệ chết có thể lên đến 100% sau 3 ngày đến 5 ngày nhiễm bệnh.

Tôm bị bệnh tập trung ở rìa ao hoặc gần mặt nước, toàn than màu nhợt nhạt.

Phần giáp đầu ngực có màu vàng và toàn thân nhợt nhạt.

5.3 Bệnh tích

Mang chuyển màu trắng, vàng hoặc nâu.

Gan tụy sưng và chuyển màu vàng.

Trong một số trường hợp tôm không xuất hiện dấu hiệu bệnh lí nhưng quan sát các tế bào gan tụy, tế bào máu, cơ quan lympho, ruột, mang, tuyến anten, mô liên kết thấy các thể vùi trong tế bào chất, nhân tế bào co rúm hoặc vỡ thành nhiều mảnh."

Theo đó, các triệu chứng lâm sàng ở tôm sú giống mà người nuôi có thể nhận biết là tôm sẽ ăn nhiều bất thường rồi đột ngột ngừng ăn và chết sau 2 đến 4 ngày. Tôm bị bệnh tập trung ở rìa ao hoặc gần mặt nước, toàn than màu nhợt nhạt và hần giáp đầu ngực có màu vàng và toàn thân nhợt nhạt.

Tôm sú giống (Nguồn ảnh: Internet)

Thực hiện phương pháp Realtime RT PCR chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm sú giống ra sao?

Theo tiểu mục 6.2 Mục 6 TCVN 8710-4:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm quy định về việc chẩn đoán bệnh bệnh đầu vàng ở tôm bằng phương pháp Realtime RT PCR như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phương pháp Realtime RT - PCR

6.2.1 Lấy mẫu (Theo 6.1.1)

6.2.2 Bảo quản mẫu (Theo 6.1.2)

6.2.3 Chuẩn bị mẫu (Theo 6.1.3)

6.2.4 Cách tiến hành

6.2.4.1 Tách chiết ARN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.3) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ARN: PureLinK Viral RNA/DNAMini kit (50) (Lot 1361246)[2]) (xem phụ lục B)

6.2.4.2 Chuẩn bị mồi

Phương pháp Realtime RT-PCR sử dụng cặp mồi YHV 141F / YHV 206R và YHV p (3.2.2) để phát hiện vi rút đầu vàng YHV1. Trình tự cặp mồi (xem phụ lục D, Bảng D.1).

Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.8) (10 µl mồi gốc và 40 µl nước tinh khiết không có nuclease).

Đoạn dò YHV-p sử dụng nồng độ 6 µM: Pha loãng đoạn dò bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.8) (3 µl mồi gốc và 47 µl nước tinh khiết không có nuclease).

6.2.4.3 Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy Realtime PCR (4.1.2) theo phương pháp Realtime RT- PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút đầu vàng YHV1 sử dụng cặp mồi YHV 141F / YHV 206R và YHV p (3.2.2) (xem phụ lục D).

6.2.4.4. Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

- Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct);

- Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct dao động ± 2.

Với điều kiện phản ứng như trên:

- Mẫu có giá trị Ct < 35 được xem là dương tính;

- Mẫu không có giá trị Ct là âm tính;

- Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 35 ≤ Ct ≤ 40 được xem là nghi ngờ.

CHÚ Ý: - Những mẫu nghi ngờ, cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả;

- Phản ứng realtime RT-PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng."

Theo đó, việc thử nghiệm tình trạng bệnh phải được thực hiện tại phòng thí nghiệm; trình tự thực hiện các bước phải tuân thủ theo quy định nêu trên.

Trong quá thực hiện phương pháp Realtime RT PCR để chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm thì người thực hiện thử nghiệm cần lưu ý gì để đảm bảo sức khỏe khi chẩn đoán?

Tại Phục lục B TCVN 8710-4:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm quy định về bước tách chiết ARN trong quá trình chẩn đoán như sau:

"CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

..."

Như vậy, khi làm tới bước tách chiết ARN tại tiểu mục 6.2.4.1 Mục 6 TCVN 8710-4:2019 thì sẽ có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận.

Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Người thực hiện chẩn đoán phải luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này để đảm bảo sức khỏe của bản thân.