Tiến hành phương pháp ELISA để chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn như thế nào? Phương pháp ELISA được thực hiện dựa trên nguyên tắc nào?

Nội dung chính

• Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn bằng phương pháp ELISA cần những thiết bị dụng cụ nào?
• Phương pháp ELISA được thực hiện dựa trên nguyên tắc nào?
• Tiến hành phương pháp ELISA để chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn như thế nào?

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn bằng phương pháp ELISA cần những thiết bị dụng cụ nào?

Theo Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-1:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 1: Bệnh lở mồm long móng quy định về thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp ELISA để chẩn chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn như sau:

Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm sinh học, bao gồm những thiết bị, dụng cụ sau:

5.1 Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung

5.1.1 Tủ lạnh: tủ lạnh thường (từ 0 °C đến 8 °C), tủ lạnh âm sâu (từ âm 20 °C đến âm 80 °C);

5.1.2 Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;

5.1.3 Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g;

5.1.4 Máy nghiền mẫu hoặc cối, chày sứ, panh, kéo, vô trùng;

5.1.5 Dụng cụ tiêu hao như: găng tay, khẩu trang, bảo hộ cá nhân.

5.2 Thiết bị, dụng cụ cho phương pháp realtime RT-PCR

5.2.1 Máy PCR, realtime PCR;

5.2.2 Máy ly tâm, có thể thực hiện ở 1500 g đến 2500 g, 10000 g và 12000 g;

5.2.3 Máy lắc ủ nhiệt;

5.2.4 Máy spindown, máy ly tâm lắng;

5.2.5 Máy chiết tách ADN/ARN tự động (nếu có);

5.3 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ELISA

5.3.1 Máy đọc ELISA, có thể đọc ở bước sóng từ 450 nm đến 650 nm;

5.3.2 Thiết bị ủ mẫu, có thể duy trì ở nhiệt độ 37 °C, tốc độ lắc từ 400 rpm đến 700 rpm.

5.4 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp phân lập vi rút trên môi trường tế bào

5.4.1 Đĩa 96 giếng, dùng cho nuôi tế bào

5.4.2 Lọ nuôi tế bào (T25);

5.4.3 Tủ ấm, có chứa 5 % CO2, duy trì được ở 37 °C;

5.4.4 Kính hiển vi soi ngược;

Ngoài ra, còn có các loại đầu tip, pipet, ống nghiệm, đĩa petri và các vật tư tiêu hao phù hợp cho quá trình thực hiện các biện pháp kỹ thuật trong tiêu chuẩn này.

Theo đó, để chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn bằng phương pháp ELISA thì cần dùng một số thiết bị dụng cụ sau:

- Máy đọc ELISA, có thể đọc ở bước sóng từ 450 nm đến 650 nm;

- Thiết bị ủ mẫu, có thể duy trì ở nhiệt độ 37 °C, tốc độ lắc từ 400 rpm đến 700 rpm.

5-Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp phân lập vi rút trên môi trường tế bào

- Đĩa 96 giếng, dùng cho nuôi tế bào

- Lọ nuôi tế bào (T25);

-Tủ ấm, có chứa 5 % CO2, duy trì được ở 37 °C;

- Kính hiển vi soi ngược.

Ngoài những thiết bịm dụng cụ dùng riêng cho phương pháp thì còn một số thiết bị dụng cụ khác để hỗ trợ quá trình chẩn đoán bệnh như:

- Tủ lạnh: tủ lạnh thường (từ 0 °C đến 8 °C), tủ lạnh âm sâu (từ âm 20 °C đến âm 80 °C);

- Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;

- Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g;

- Máy nghiền mẫu hoặc cối, chày sứ, panh, kéo, vô trùng;

- Dụng cụ tiêu hao như: găng tay, khẩu trang, bảo hộ cá nhân.

Tiến hành phương pháp ELISA để chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn (Hình từ Internet)

Phương pháp ELISA được thực hiện dựa trên nguyên tắc nào?

Theo tiết 7.2.1 tiểu mục 7.2 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-1:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 1: Bệnh lở mồm long móng quy định về phương pháp ELISA như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

7.2 Phát hiện kháng nguyên

7.2.1 Phương pháp ELISA

- Nguyên tắc: Phản ứng Sandwich ELISA gián tiếp phát hiện nhiều typ kháng nguyên (O, A, C và Asia 1). Phản ứng được thực hiện trên đĩa đáy bằng 96 giếng. Khi sử dụng kít ELISA, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Các bước tiến hành tham khảo Phụ lục B.

...

Phương pháp ELISA hoạt động theo nguyên tắc của phản ứng Sandwich ELISA gián tiếp phát hiện nhiều typ kháng nguyên (O, A, C và Asia 1. Phản ứng được thực hiện trên đĩa đáy bằng 96 giếng. Khi sử dụng kít ELISA, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Tiến hành phương pháp ELISA để chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn như thế nào?

Theo Phụ lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-1:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 1: Bệnh lở mồm long móng quy định về cách tiến hành phương pháp ELISA như sau:

B.1 Cách tiến hành

- Gắn đĩa (coating): Kháng huyết thanh thỏ kháng vi rút lở mồm long móng của các typ O, A, C và Asia 1 pha loãng 1:1000 với dung dịch đệm carbonat/ bicarboant (xem Phụ lục A), nhỏ 50 µl vào các giếng tương ứng. Đậy nắp, ủ và lắc ở nhiệt độ 37 °C trong 1 giờ hoặc ủ qua đêm ở 4 °C.

- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002 M (xem Phụ lục A).

- Nhỏ 50 µl kháng nguyên đối chứng dương tính mạnh (1:10) và yếu (1:100) pha loãng bằng dung dịch đệm A (xem Phụ lục A) và mẫu bệnh phẩm vào các giếng quy định, ủ và lắc ở nhiệt độ 37 °C trong 1 giờ.

- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002 M.

- Nhỏ kháng thể phát hiện: Mỗi giếng nhỏ 50 µl kháng huyết thanh chuột lang kháng vi rút lở mồm long móng vào các giếng tương ứng, mỗi serotyp được pha loãng (1:100) với dung dịch đệm B (xem Phụ lục A). Đậy nắp, ủ và lắc ở nhiệt độ 37 °C trong 1 giờ.

- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002 M

- Nhỏ dung dịch Conjugate (1:200 pha với dung dịch đệm B): 50 µl/giếng.

- Đậy nắp, ủ và lắc ở nhiệt độ 37°C trong 45 phút.

- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002 M

- Nhỏ cơ chất chromogen (dung dịch chromogen + 5 % cơ chất H2O2 3%): 50 µl/giếng, để 15 phút ở nhiệt độ phòng, nơi tối.

- Dừng phản ứng: nhỏ dung dịch H2SO4 1,25 M với 50 µl/giếng.

...

Như vậy, các bước tiến hành phương pháp ELISA để chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở lợn được thực hiện theo tiêu chuẩn nêu trên.