Có bao nhiêu bước chuẩn bị phản ứng Nested PCR khi áp dụng phương pháp Nested PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm?

Nội dung chính

• Trong phương pháp Nested PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm cần chuẩn bị cặp mồi nào?
• Thực hiện cặp mồi khi thực hiện phương pháp Nested PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm theo trình tự nào?
• Có bao nhiêu bước chuẩn bị phản ứng Nested PCR khi áp dụng phương pháp Nested PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm?

Trong phương pháp Nested PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm cần chuẩn bị cặp mồi nào?

Theo Mục 3 TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm quy định về thuốc thử và vật liệu thử ở tôm sú giống khi có biểu hiện bệnh như sau:

"3 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung

3.1.1 Etanol, từ 96 % đến 100 % (C2H6O).

3.1.2 Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS).

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR và realtime PCR

3.2.1 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược.

3.2.2 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược, Dò.

3.2.3 Kít tách chiết ADN (Xem B1 và B2)

3.2.4 Kít nhân gen PCR (PCR Master Mix Kit, Cat. No K0171).

3.2.5 Kít nhân gen Realtime PCR ( ví dụ: Kít Platinum® Quantitative PCR SuperMix-UDG, Cat.No: 11730-017).

3.2.6 Dung dịch đệm TAE (Tris - acetate - EDTA) hoặc TBE (Tris - brorate - EDTA) (xem A.1).

3.2.7 Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe.

3.2.8 Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X).

3.2.9 Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.10 Thang chuẩn AND (Ladder).

3.2.11 Nước tinh khiết, không có nuclease.

3.2.12 Agarose."

Theo đó, khi thực hiện phương pháp Nested PCR cần chuẩn bị cặp mồi xuôi và mồi ngược; dặp mồi xuôi và mồi ngược, Dò.

Có bao nhiêu bước chuẩn bị phản ứng Nested PCR khi áp dụng phương pháp Nested PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm? (Hình từ Internet)

Thực hiện cặp mồi khi thực hiện phương pháp Nested PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm theo trình tự nào?

Theo Mục C.1 Phụ lục C TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm quy định về trình tự cặp mồi như sau:

C.1 Trình tự cặp mồi

Như vậy, việc cặp mồi trong quá trình thực hiện chẩn đoán bệnh đốm trắng bằng phương pháp Nested PCR được thực hiện theo trình tự như sau:

- 146F1: 5’-ACT-ACT-AAC-TTC-AGC-CTA-TCTAG-3’

- 146R1: 5’-TAA-TGC-GGG-TGT-AAT-GTT-CTT-ACG-A-3’

- 146F2: 5’-GTA-ACT-GCC-CCT-TCC-ATC-TCC-A-3’

- 146R2: 5’-TAC-GGC-AGC-TGC-TGC-ACC-TTG-T-3’

Ngoài ra, cặp mồi còn phải đáp ứng đúng kích thước quy định như sau:

- Đối với cặp mồi 146F1 và cặp mồi 146R1 kích thước phải đạt 1447 bp

- Đối với cặp mồi 146F2 và cặp mồi 146R2 kích thước phải đạt 941 bp

Có bao nhiêu bước chuẩn bị phản ứng Nested PCR khi áp dụng phương pháp Nested PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm?

Theo Mục C.2 Phụ lục C TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm quy định về các bước thực hiện phản ứng Nested PCR như sau:

"C.2 Thực hiện phản ứng Nested PCR

Kỹ thuật nested PCR bao gồm 2 giai đoạn (hoặc 2 bước):

Giai đoạn 1 (bước 1): Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi 146F1/146R1 đã được chuẩn bị và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho 1 phản ứng bước 1 (xem Bảng C.2).

VÍ DỤ: Sử dụng kít nhân gen PCR Master mix của Thermo, Cat.No: #k0171.[5])

Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 2,5 µl mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng WSSV chuẩn.

Mẫu đối chứng âm: Cho 2,5 µl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 2,5 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.3).

Giai đoạn 2 (bước 2): Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi 146F2/146R2 đã được chuẩn bị và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho 1 phản ứng bước 2 (xem Bảng C.4).

VÍ DỤ: Sử dụng kít nhân gen PCR Master mix của Thermo, Cat.No: #k0171.[6])

Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu đối chứng dương: chuyển 2,5 µl sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới

- Mẫu đối chứng âm: chuyển 2,5 µl sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới

- Mẫu thử: chuyển 2,5 µl sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.5)

Kết thúc chu trình nhiệt của phản ứng Nested PCR tiến hành điện di theo (6.1.4.4)"

Từ quy định trên thì phản ứng Nested PCR trong phương pháp Nested PCR có hai bước thực hiện:

- Bước 1: Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi 146F1/146R1 đã được chuẩn bị và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Bước 2: Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi 146F2/146R2 đã được chuẩn bị và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Quy trình cũng như các phản ứng xảy ra trong quá trình thực hiện phản ứng được quy định chi tiết tại Mục C.2 Phụ lục C TCVN 8710-3:2019 nêu trên.