Cần chuẩn bị những gì khi tiến hành quy trình tách chiết ADN trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh herpesvisus ở cá chép?

Nội dung chính

• Cần lấy bao nhiêu mẫu bệnh để có thể chẩn đoán bệnh herpesvirus bằng phương pháp PCR?
• Cần chuẩn bị những gì khi tiến hành quy trình tách chiết ADN trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh herpesvisus ở cá chép?
• Quá trình tách chiết ADN trong phương pháp PCR được thực hiện như thế nào?

Cần lấy bao nhiêu mẫu bệnh để có thể chẩn đoán bệnh herpesvirus bằng phương pháp PCR?

Theo tiết 6.1.1 tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-6:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép quy định về việc lấy mẫu bệnh để chẩn đoán bệnh herpesvirus như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm

6.1.1 Lấy mẫu

- Cá có kích thước nhỏ hơn 4 cm: Lấy cả con từ 5 con đến 10 con;

- Cá có kích thước từ 4 cm đến 6 cm: Lấy mang và toàn bộ phủ tạng từ 5 con đến 10 con;

- Cá có kích thước trên 6 cm: Lấy mang, thận và lách từ 5 con.

CHÚ THÍCH: Khi xét nghiệm cá nhiễm bệnh cận lâm sàng, có biểu hiện khỏe mạnh, ngoài các mẫu mang, thận, lách cần thu thập thêm mẫu ruột và não. Trong trường hợp thực hiện chương trình giám sát bệnh do KHV. Cá được lưu giữ ở nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của KHV (nhiệt độ trên 17 °C) trong khoảng thời gian 3 tuần. Sau đó, thu mẫu cá đối với những cá có dấu hiệu bệnh hoặc xuất hiện những dấu hiệu bất thường, để kiểm tra sự hiện diện của KHV.

Mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cả được đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C. Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm, nếu quá thời gian đó, bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ đông băng từ âm 20 °C đến âm 80 °C, hoặc có thể bảo quản mẫu trong cồn từ 96 % đến 100 % theo tỉ lệ mẫu: cồn (1:10).

..."

Số lượng mẫu bệnh cần lấy để tiến hành chẩn đoán bệnh herpesvirus ở cá chép sẽ tùy vào kích thước của cá:

- Cá có kích thước nhỏ hơn 4 cm: Lấy cả con từ 5 con đến 10 con;

- Cá có kích thước từ 4 cm đến 6 cm: Lấy mang và toàn bộ phủ tạng từ 5 con đến 10 con;

- Cá có kích thước trên 6 cm: Lấy mang, thận và lách từ 5 con.

Cần chuẩn bị những gì khi tiến hành quy trình tách chiết ADN trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh herpesvisus ở cá chép?

Theo Mục B.1 Phục lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-6:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép quy định về bước chuẩn bị tách chiết ADN như sau:

"B.1 Chuẩn bị

- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thêm Proteinase K và Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 °C đến 30 °C.

- Dung dịch hạt từ (Bead Mix): Cho dung dịch MAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100 % vào dung dịch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi ADN/ARN sau khi tách chiết được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kít."

Như vậy, để tiến hành bước tách chiết ADN thì người tiến hành chẩn đoán cần chuẩn bị:

- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV;

- Dung dịch hạt từ (Bead Mix);

- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2);

- Dung dịch Elution Buffer.

Quy trình tách chiết ADN để chẩn đoán bệnh herpesvirus trên cá chepsp bằng phương pháp PCR (Hình từ internet)

Quá trình tách chiết ADN trong phương pháp PCR được thực hiện như thế nào?

Theo Mục B.2 Phục lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-6:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép quy định về việc tiến hành tách chiết ADN như sau:

"B.2 Tiến hành chiết tách mẫu tự động bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF

- Hút 200 μl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu.

- Giải đông, vortex huyễn dịch 10 % mẫu đã chuẩn bị ở mục 7.1.2. Sau đó tiến hành ly tâm 2500 g trong 15 phút. Hút 200 μl dịch trong bên trên vào ống Lysis buffer và trộn đều.

- Ly tâm lắng (5.2.4) để kéo các phần bám trên nắp ống eppendorf xuống.

- Đặt ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt (5.2.3), lắc với vận tốc 750 g trong 15 phút ở nhiệt độ 65 °C.

- Lấy các ống eppendorf ra khỏi máy lắc ủ nhiệt (5.2.3) và sắp xếp thứ tự trên khay.

- Chuẩn bị các đĩa 96 giếng sâu và đĩa 96 thu hồi ADN/ARN của kít

- Hút dung dịch mẫu sau khi lắc nhiệt vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 theo sơ đồ mẫu. Đĩa 96 giếng sâu thứ 2: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 1, Đĩa 96 giếng sâu thứ 3 và 4: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 2, đĩa 96 giếng thu hồi ADN/ARN cho vào 100 μl dung dịch Elution Buffer.

- Sau đó cho thêm vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 (giếng chứa hỗn hợp mẫu và dung dịch đệm Lysis Buffer) 420 μl dung dịch hạt từ.

- Chọn chương trình máy chiết tách theo hướng dẫn của nhà sản xuất để gắn các đĩa mẫu và dung dịch chiết tách vào bên trong máy chiết tách.

- Vận hành máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Sau khi chiết tách ADN/ARN đã hoàn tất. Lấy đĩa thu ADN/ARN ra khỏi máy và đặt vào tủ an toàn sinh học cấp 2.

- Hút toàn bộ dung dịch trong giếng đĩa thu ADN/ARN cho vào ống thu hồi 500 μl vô trùng đã ghi sẵn ký hiệu mẫu chiết tách tương ứng.

- Mẫu ADN/ARN được bảo quản ở 4°C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime PCR/PCR. Trong trường hợp mẫu ADN/ARN chưa thực hiện phản ứng realtime PCR/ PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80°C."

Theo đó, quá trình tách chiết ADN trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh herpesvirus trên cá chép được thực hiện theo các bước như quy Tiêu chuẩn vừa nêu trên.